EZfusion同源重组酶是利用PCR产物或是其它DNA片段具有和线性载体末端相同的重叠序列,将PCR产物定向克隆到任意载体的任意位置,使得PCR产物克隆变的更快速,高效。
EZfusion定向克隆的实验原理及操作流程
图1. EZfusion实验流程
首先通过酶切或是PCR扩增将环状载体线性化。同时制备待插入的PCR片段,其中扩增PCR片段的引物5’端添加与线性化载体末段序列(如图中红色和黄色标记)相同的一段DNA序列(一般15bp-20bp),使得扩增产物5’和3’端分别带上和线性化载体末端一致的序列,实现定向克隆的目的。将线性化载体和插入片段加入连接体系,在EZfusion同源重组酶的作用下,实现重组连接并转化,在平板上会形成数百个单克隆菌斑以供后期阳性筛选。
图2. EZfusion引物设计
使用EZfusion同源重组酶进行克隆实验中,扩增插入片段的引物一般由与线性化载体两端序列一致的15bp-20bp序列(图中的同源序列)和特异性基因序列(图中的特异序列,其长度没有严格要求)组成。EZfusion同源重组酶可以根据这一特性,实现高效的定向克隆。
图3. 阳性筛选
使用EZfusion同源重组酶将2000bpPCR产物与pGH载体(Generay常规克隆载体)进行定向克隆后,,通过菌液PCR方法检测单克隆菌落。显示出具有较高的阳性克隆率。
产品优势
快速-----室温条件(25℃)下,20分钟反应即可
灵活-----在载体上的任何位置均可实现连接入DNA片段,消除或是减弱内切酶依赖性。
简便-----只需要将载体线性化,载体及片段不必再考虑是否需要磷酸化,是否粘端还是平端等,保证插入DNA片段定向克隆到任意载体的任意位置,同时也省去连接酶的使用。
高效-----连接效率高,无需蓝白斑筛选,阳性率>99%。
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